使用超聲波破碎細(xì)胞的相關(guān)問(wèn)題

眾所周知，儀器設(shè)備在使用過(guò)程中或多或少都會(huì)遇到一些狀況，當(dāng)然超聲波細(xì)胞破碎儀也不例外，下面由我們凈信來(lái)為大家介紹下超聲波細(xì)胞破碎儀的常見(jiàn)問(wèn)題：

大腸桿菌表達(dá)外源蛋白，在超聲破碎的時(shí)候，用含有1%triton-X-100的PBS懸浮，然后超聲的效果較好，1%triton-X-100的作用還是很明顯的，對(duì)其他的一些細(xì)菌同樣起作用，比如鏈霉菌。

細(xì)菌沉淀直接加樣品1buffer，再加5ul的巰基乙醇，混勻，離心，煮沸10min，直接上樣，染色脫色步驟如下:將膠放入適量的染色液微波爐里加熱1min(下次適當(dāng)補(bǔ)點(diǎn)醋酸即可),將染色液換成大量的水(自來(lái)水即可)在微波爐煮10min 就可以。

在表達(dá)重組蛋白后超聲波破碎細(xì)胞，采用冰浴，400w，破2s停1s，但是不一會(huì)就產(chǎn)生大量泡沫，影響了破碎功率，pbs和tris緩沖液都是這樣，最后都是破碎不完全，而我的目的蛋白就在這些未破碎的細(xì)胞中。

• 1*會(huì)產(chǎn)生氣泡是因?yàn)槟愕奶筋^位置沒(méi)放好。探頭一定要接近底部，約1cm（我一般是距底部0.5mm）。功率根據(jù)儀器不同會(huì)有所不同，但你可以觀察液面，有波動(dòng)但不要太劇烈就好。
• 2*破3S停10S，破個(gè)二三十次看看。
• 3*變幅桿位置擺放也要注意，聽(tīng)聲音如果不對(duì)的話(huà)就要及時(shí)調(diào)整。另外可以從菌濃度方面考慮。 在破碎時(shí)，試著加大體積,強(qiáng)度最好不要超過(guò)60%.
• 4*嘗試超8s停8s,對(duì)有些菌體蛋白來(lái)說(shuō)，你的方法很難散熱，導(dǎo)致蛋白變性產(chǎn)生氣泡，最好停頓時(shí)間稍長(zhǎng)一些，這種情況多見(jiàn)于包涵體形式的蛋白。

鏈霉菌（放線(xiàn)菌）超聲破碎的，用的方法條件是什么？前處理一般就是配置成一定濃度的菌懸液。使用超聲破碎時(shí)采用的具體條件是：

• (1)取細(xì)菌的24 h培養(yǎng)液于5 000 r／min 下離心5 min收集菌體．
• (2)用pH 7．5的Na2HPO -NaH2PO 緩沖液洗滌3次，再用該緩沖液將菌體配成1：3的菌懸液．置于40mL大塑料試管內(nèi)．
• (3)將大塑料試管置于冰浴中，采用超聲波破碎(功率200 W，1／2”探頭，破碎30 s，間歇30 S)．
• (4)破碎液于12 000 r／min下高速冷凍離心30 min，收集細(xì)胞碎片和上清夜．

超聲破菌流程與 上述基本一致，就是洗滌菌體也可以用預(yù)冷的生理鹽水或pH8的Tris－HCl，洗滌一次就可以。另外，超聲劑量隨樣品量、菌體改變比較大，功率可以到400－600w，超5s，停5s，冰浴，要加終濃度1 mM的PMSF。為確定合適的超聲強(qiáng)度和次數(shù)，有必要隨時(shí)鏡檢觀察菌體是否完全破碎。

放線(xiàn)菌屬于原核生物系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上的（G＋C）摩爾百分含量（mol％）高的革蘭氏陽(yáng)性菌（Eubacteria）分枝類(lèi)群，它雖然具有原核生物特有的分子生物學(xué)特性，但在其不同類(lèi)群中，細(xì)胞壁的化學(xué)組分變化很大。

在做大腸桿菌超聲時(shí)，采用的是400W，超5停5的方法，效果不錯(cuò)，但是用在鏈霉菌上，似乎沒(méi)什么效果。會(huì)不會(huì)就是由于細(xì)胞壁組成差異造成的呢，因?yàn)榇竽c桿菌式屬于革蘭氏陰性菌的。

再有鏡檢是檢驗(yàn)破碎效果,但是細(xì)胞破碎程度和我需要的酶獲得之間有正比關(guān)系嗎？破碎時(shí)間長(zhǎng)也會(huì)影響到酶的活性。所以想問(wèn)問(wèn)anaisai戰(zhàn)友，你提供的“功率200 W，1／2”探頭，破碎30 s，間歇30 S”的條件好像是用于破碎鏈霉菌孢子的，也可以用于發(fā)酵離心后的菌泥嗎？如果可以，你破碎的全程時(shí)間大概是多少呢？ 

如果你需要的是胞內(nèi)酶，細(xì)胞破碎程度和需要的酶獲得之間基本上有正比關(guān)系。破碎時(shí)間長(zhǎng)的確會(huì)影響到酶的活性。這就需要在最佳的破碎時(shí)間和酶活性之間做出判斷，最直接的辦法是先繪制相關(guān)曲線(xiàn)（酶活性和時(shí)間的關(guān)系曲線(xiàn)）。

實(shí)驗(yàn)中，破碎的是棒狀桿菌（也是很難破壁的G+菌），破碎時(shí)間控制在30min左右，酶活較好。 如果是基質(zhì)菌絲的話(huà),好可以考慮用溶菌酶處理一下.一般來(lái)講這幾種方法讀可以的:

• 一,液氮研磨
• 二,用french press破碎
• 三，超聲波破碎
• 四，溶菌酶處理預(yù)處理

超聲波是物質(zhì)介質(zhì)中的一種彈性機(jī)械波，它既是一種波動(dòng)形式,又是一種能量形式。超聲對(duì)細(xì)胞的作用主要有熱效應(yīng)，空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)。熱效應(yīng)是當(dāng)超聲在介質(zhì)中傳播時(shí)，摩擦力阻礙了由超聲引起的分子震動(dòng)，使部分能量轉(zhuǎn)化為局部高熱（42－43℃）。空化效應(yīng)是在超聲照射下，生物體內(nèi)形成空泡，隨著空泡震動(dòng)和其猛烈的聚爆而產(chǎn)生出機(jī)械剪切壓力和動(dòng)蕩。另外，空化泡破裂時(shí)產(chǎn)生瞬時(shí)高溫（約5000℃）、高壓（可達(dá)500×104Pa），可使水蒸氣熱解離產(chǎn)生.OH自由基和.H原子，由.OH自由基和.H原子引起的氧化還原反應(yīng)，可導(dǎo)致多聚物降解、酶失活、脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞殺傷。機(jī)械效應(yīng)是超聲的原發(fā)效應(yīng)，超聲波在傳播過(guò)程中介質(zhì)質(zhì)點(diǎn)交替地壓縮與伸張構(gòu)成了壓力變化，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷。損傷作用的強(qiáng)弱與超聲的頻率和強(qiáng)度密切相關(guān)。100g大腸桿菌溶于1L破碎液里（破碎掖：50mM Tris-Cl(PH8.5) 5mM EDTA 0.14M NaCl），攪拌，發(fā)現(xiàn)菌液發(fā)粘，菌體不能夠很好分散，用高壓勻質(zhì)機(jī)破碎，加壓后，菌液不能進(jìn)入勻質(zhì)機(jī)，速度很慢，

請(qǐng)問(wèn)是何原因？能有好的辦法解決，很好用勻質(zhì)機(jī)快速破碎菌體？

將破碎液的量加大，不能很好分散可能是量太大 。超聲處理5－10分鐘，菌液粘度即可大大降低，也可促進(jìn)菌體分散。不同型號(hào)的設(shè)備功率不一樣，功率的大小決定了使用變幅桿的大小范圍（直徑2mm至幾十毫米），你使用多大的變幅桿就在設(shè)備的上調(diào)至該刻度（很簡(jiǎn)單的）！變幅桿的大小決定了處理量5ml一下選3mm，5～50ml可選6～8mm，50ml以上選10mm的變幅桿，依此類(lèi)推！占空比不用關(guān)心的，主要是指超聲時(shí)間和停頓時(shí)間的比值。 

酵母破碎的問(wèn)題

一般的PROTOCOL都是用glass beads  破碎酵母細(xì)胞sigma G-8772 酵母破碎效果好的我所做過(guò)的方法中還是玻璃珠，效率很高，而且對(duì)目的蛋白活性不會(huì)有什么影響。一般應(yīng)該用這個(gè)方法。

化學(xué)裂解的方法，10g酵母 加1ml的乙酸乙酯，充分?jǐn)嚢柚烈后w狀。此法的裂解效果不錯(cuò)的加尿素裂解液（尿素8mol/L, NaCl 0.5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值8.0），據(jù)說(shuō)效果可以。

畢氏酵母細(xì)胞破碎法

在破碎遇到的問(wèn)題是菌體濃度太低，OD620nm在4-6之間。細(xì)胞破碎儀的最低破碎體積為4ml左右，這樣再稀釋一倍，OD就到2-3啦，我們懷疑破碎完溶出蛋白和酶活測(cè)定時(shí)會(huì)測(cè)不準(zhǔn)。所以請(qǐng)教大家細(xì)胞破碎時(shí)，最低的菌濃多少為下限？我們的菌是一種棒桿菌。 破碎后，你可將液體放入透析袋中濃縮。

我們所做的方法是按照1：20的比例將離心后的菌體（e.coli）溶解于超聲緩沖液（50mM 磷酸 pH8.0 ）300w 10s/10s 破碎20分鐘。做了鏡檢！基本全被破碎了！我做蛋白純化的，做的包涵體。實(shí)驗(yàn)中，我們的菌體濃度相對(duì)獨(dú)立，與培養(yǎng)液中的菌體od無(wú)關(guān)，不收其限制，便于操作者調(diào)控。一般按每g濕菌體加5-10ml裂菌緩沖液。超聲肯定會(huì)產(chǎn)熱，所以一定要有降溫裝置，除非你需要得成分耐高溫。

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